產(chǎn)品名稱：人磷酸化AKT蛋白(p-AKT)ELISA試劑盒

產(chǎn)品規(guī)格：48T/96T

實驗原理

本試劑盒應用雙抗體夾心法測定標本中指標水平。用純化的指標抗體包被微孔板，制成固相抗體，往包被單抗的微孔中依次加入指標，再與HRP標記的-O-甲基轉移酶（COMT）抗體結合，形成抗體-抗原-酶標抗體復合物，經(jīng)過 洗滌后加底物TMB顯色。TMB在HRP酶的催化下轉化成藍色，并在酸的作用下轉化成最終的黃色。顏色的深淺和樣品中的指標呈正相關。用酶標儀在450nm波長下測定吸光度（OD值），通過標準曲線計算樣品中指標濃度。

標本要求

1．標本采集后盡早進行提取，提取按相關文獻進行，提取后應盡快進行實驗。若不能馬上進行試驗，可將標本放于-20℃保存，但應避免反復凍融

2．不能檢測含NaN3的樣品，因NaN3抑制辣根過氧化物酶的（HRP）活性。

人磷酸化AKT蛋白(p-AKT)ELISA試劑盒操作步驟：

1. 標準品的稀釋：本試劑盒提供原倍標準品一支，用戶可按照下列圖表在小試管中進行稀釋。

2. 加樣：分別設空白孔（空白對照孔不加樣品及酶標試劑，其余各步操作相同）、標準孔、待測樣品孔。在酶標包被板上標準品準確加樣50μl，待測樣品孔中先加樣品稀釋液40μl，然后再加待測樣品10μl（樣品最終稀釋度為5倍）。加樣將樣品加于酶標板孔底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動混勻。

3. 溫育：用封板膜封板后置37℃溫育30分鐘。

4. 配液：將30倍濃縮洗滌液用蒸餾水30倍稀釋后備用

5. 洗滌：小心揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿洗滌液，靜置30秒后棄去，如此重復5次，拍干。

6. 加酶：每孔加入酶標試劑50μl，空白孔除外。

7. 溫育：操作同3。

8. 洗滌：操作同5。

9. 顯色：每孔先加入顯色劑A50μl，再加入顯色劑B50μl，輕輕震蕩混勻，37℃避光顯色10分鐘.

10. 終止：每孔加終止液50μl，終止反應（此時藍色立轉黃色）。

11. 測定：以空白孔調(diào)零，450nm波長依序測量各孔的吸光度（OD值）。 測定應在加終止液后15分鐘以內(nèi)進行。

為了便于計算，盡管濃度為自變量而 O.D. 值為因變量，我們繪圖時仍采用標準品的 O.D. 值作為橫坐標 （X 軸），標準品

的濃度為縱坐標 （Y 軸）。同時為了試驗結果的直觀性，圖中提供的是原始數(shù)據(jù)而非對數(shù)值。使用對數(shù) 值建立標準曲線圖

。由于實驗操作條件的不同（如操作者、移液技術、洗板技術和溫度條件等），標準曲線的 O.D. 值會有所差異。

所提供的標準曲線僅供參考，實驗者需要根據(jù)自已的實驗建立標準曲線。

操作注意事項

1.試劑應按標簽說明書儲存，使用前恢復到室溫。稀稀過后的標準品應丟棄，不可保存。

2.實驗中不用的板條應立即放回包裝袋中，密封保存，以免變質(zhì)。

3.不用的其它試劑應包裝好或蓋好。不同批號的試劑不要混用。保質(zhì)前使用。

4.使用一次性的吸頭以免交叉污染，吸取終止液和底物A、B液時，避免使用帶金屬部分的加樣器。

5.使用干凈的塑料容器配置洗滌液。使用前充分混勻試劑盒里的各種成份及樣品。

6.洗滌酶標板時應充分拍干，不要將吸水紙直接放入酶標反應孔中吸水。

7.底物A應揮發(fā)，避免長時間打開蓋子。底物B對光敏感，避免長時間暴露于光下。避免用手接觸，有毒。實驗完成后應立即讀取OD值。

8.加入試劑的順序應一致，以保證所有反應板孔溫育的時間一樣。

9.按照說明書中標明的時間、加液的量及順序進行溫育操作。

10．試劑盒保存：；2-8℃。

11．有效期：6個月更多產(chǎn)品詳情聯(lián)系我們

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