細(xì)胞收到后處理

培養(yǎng)至良好狀態(tài)后灌滿wan全培養(yǎng)液并封好瓶口是運輸細(xì)胞的辦法.收到細(xì)胞用75%酒精噴灑整個細(xì)胞瓶,消毒后放到超凈臺內(nèi)嚴(yán)格無菌操作,將細(xì)胞瓶放入37℃ 5%CO₂的培養(yǎng)箱中靜置3-4小時以穩(wěn)定細(xì)胞狀態(tài)后再做處理.顯微鏡觀察細(xì)胞生長情況,并對細(xì)胞進(jìn)行不同倍數(shù)拍照保存（40x,100x,200x各一張）,前三天照片是重要售后依據(jù),不提供照片默認(rèn)收到狀態(tài)良好.（換液后將瓶蓋擰松）

細(xì)胞培養(yǎng)步驟

a 細(xì)胞傳代：如果未超過80%匯合度時,將瓶裝的wan全培養(yǎng)液收集至離心管中,留5mlwan全培養(yǎng)基,放入37℃ 5%CO₂孵箱培養(yǎng)；如果細(xì)胞密度超80%,即可進(jìn)行傳代培養(yǎng).

貼壁細(xì)胞傳代步驟如下：

1. 棄去培養(yǎng)上清,用不含鈣 鎂離子的PBS潤洗細(xì)胞1-2次.

2. 添加0.25%胰蛋白酶消化液約1-2ml至培養(yǎng)瓶中,置于37℃培養(yǎng)箱中消化1-2min,然后在顯微鏡下觀察細(xì)胞消化情況,若細(xì)胞大部分變圓并脫落,迅速拿回操作臺,輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加5ml以上wan全培養(yǎng)基終止消化.

3.輕輕吹打細(xì)胞,使之wan全脫落后吸出,然后將懸液轉(zhuǎn)移至15ml離心管中,在1000RPM條件下離心5分鐘,棄去上清液,補(bǔ)加1-2mLwan全培養(yǎng)基重懸.

4. 將細(xì)胞懸液按1：2的比例進(jìn)行分瓶傳代（兩個T25瓶）,補(bǔ)充新的wan全培養(yǎng)基至5-8ml/瓶,最后放入到37℃ 5%CO₂的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng).

懸浮細(xì)胞傳代步驟日下：

1 半換液法

半換液處理,豎著培養(yǎng)瓶在培養(yǎng)箱靜置1小時左右,輕輕吸掉3ml左右培養(yǎng)基,然后補(bǔ)給3ml的wan全培養(yǎng)基,如果培養(yǎng)基變色慢,可直接加500ul左右FBS,傳代的時候可以直接補(bǔ)給5ml培養(yǎng)基  分兩個培養(yǎng)瓶培養(yǎng),一般這樣傳代3次左右可以離心傳代一次,去掉死細(xì)胞.

2 離心換液法

如需分瓶可以將細(xì)胞懸液收集到離心管中1000rpm,離心5min,棄去上清,補(bǔ)加1-2mL培養(yǎng)液后重懸混勻后將細(xì)胞懸液按1：2的比例分到新T25瓶中,添加6-8ml按照說明書要求配置的新的wan全培養(yǎng)基以保持細(xì)胞的生長活力,后續(xù)傳代根據(jù)實際情況按1:2~1:5的比例進(jìn)行.

b 細(xì)胞凍存：

1 細(xì)胞生長至覆蓋培養(yǎng)瓶的80%面積時,棄T25培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)液,用PBS清洗細(xì)胞一次；

2 添加0.25%胰蛋白酶消化液約1ml至培養(yǎng)瓶中,倒置顯微鏡下觀察,待細(xì)胞回縮變圓后加入5mlwan全培養(yǎng)液終止消化,再輕輕吹打細(xì)胞使之脫落,然后將懸液轉(zhuǎn)移至15ml離心管中,1000rpm離心 5min；

3 棄上清,沉淀細(xì)胞加入1ml的雅吉生物無血清凍存液（貨號：C7001）,混勻后加入凍存管中.

4 將凍存細(xì)胞直接放入-80℃冰箱即可,如后期要將細(xì)胞轉(zhuǎn)入液氮罐中,則需在-80℃冰箱 中存放24小時以上再轉(zhuǎn)入液氮罐中.

C 細(xì)胞復(fù)蘇：

1 從液氮中取出細(xì)胞凍存管（注意佩戴防護(hù)面具）,快速將其置入 37℃水浴中解凍, 直至凍存管中無結(jié)晶,然后用75%的酒精擦拭凍存管外壁；

2 將凍存管中的細(xì)胞移至含 5ml wan全培養(yǎng)基的15ml離心管中,1000rpm離心5min；

3 棄上清,沉淀用5mlwan全培養(yǎng)基重懸,接種至T25培養(yǎng)瓶,放于37℃,5%CO₂細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；

4 第二天,換用新鮮wan全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng).

注意事項：有些細(xì)胞貼壁不牢,在運輸過程中容易發(fā)生細(xì)胞脫落,這是正?，F(xiàn)象.如脫離較多可將培養(yǎng)瓶所有培養(yǎng)液收集至離心管,1000rpm離心5min,收集上清作過渡培養(yǎng)（后期對比培養(yǎng)）,沉淀加入胰酶1-2ml,輕輕吹打,重懸,消化1-2分鐘后,加5mlwan全培養(yǎng)基終止反應(yīng).再離心,棄上清,加1-2mlwan全培養(yǎng)基重懸.然后按1:2比例進(jìn)行分瓶傳代（兩個T25）,補(bǔ)充新的wan全培養(yǎng)基至5-8ml/瓶,最后放入37℃,5%CO₂細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng).